A fase móvel é um dos principais constituintes que fazem parte das análises de HPLC, ou análises cromatográficas.
O cuidado durante o preparo da fase móvel utilizada no método desenvolvido e validado para sua análise é de extrema importância, uma vez que quando originado um problema, pode influenciar negativamente nos resultados obtidos.
Além disso, podem causar problemas na coluna cromatográfica e consequentemente danificar a fase estacionária.
Que tal saber mais sobre esses tipos de problemas? Continue a leitura!
Análises de HPLC/UHPLC e os problemas nas fases móveis
Os principais problemas que podem acontecer em uma fase móvel são:
- presença de contaminantes;
- fungos ou algas nas soluções tampão;
- presença de bolhas ou gases dissolvidos;
- reagentes de pareamento iônico.
Os problemas da fase móvel são decorrentes, normalmente, de contaminantes nos solventes utilizados na preparação.
Em análises de HPLC utilizando fase reversa (colunas com fase estacionária de características apolares), a água comumente é usada como uma fase móvel, sendo esse solvente considerado a principal fonte de contaminação.
A água deve sempre ser ultrapura, no entanto, equipamentos que fazem a ultrapurificação de água contém substâncias orgânicas, as quais podem passar para a água e, consequentemente, ir para o sistema cromatográfico.
Esses contaminantes podem ser evitados passando a água por carvão ativado, seguido de uma filtração, ou ainda com uma coluna preparativa (C18).
A fase móvel pode ser constituída de solventes orgânicos puros (como metanol ou acetonitrila, em fase reversa), água pura ou ainda soluções tampão.
Todos os solventes utilizados em uma análise cromatográfica devem possuir alto grau de pureza (grau HPLC) e ainda devem ser filtradas com filtros de 0,2 ou 0,45 µm.
Dependendo da característica físico-química do analito de interesse, o pH da fase móvel deve ser ajustado, e sempre deve ter atenção a faixa de pH suportado pela coluna cromatográfica.
As soluções tampão podem proporcionar o crescimento de fungos, e caso isso aconteça, as soluções devem ser descartadas. Ainda, uma solução tampão possui a presença de sais, que, se não bem filtrados, podem entrar no sistema HPLC ou UHPLC e causar diversos problemas, como entupimento dos canais e principalmente deterioração da fase estacionária, presente na coluna cromatográfica.
Partículas de sais também causam deterioração da coluna cromatográfica, já que sua precipitação dentro dela leva a seu entupimento, impedindo que a análise ocorra de forma eficiente.
Como podem ser detectados os problemas a análises HPLC/UHPLC
Os problemas relacionados à fase móvel podem ser detectados no cromatograma, como desvio da linha de base, picos que não deveriam aparecer, ruídos excessivos ou falta do pico do analito no cromatograma, decorrente do entupimento da coluna.
O emprego de fase móvel contaminada ou com problemas pode causar grandes danos nos canais do equipamento, na coluna cromatográfica e ainda no detector.
As colunas devem ser a principal preocupação quando evidenciado algum problema, já que as partículas da fase estacionária podem ser degradadas ou ainda reagir de outra forma com os contaminantes presentes na fase móvel.
Sendo assim, toda fase móvel e todos analitos utilizados em uma análise devem ser cuidadosamente preparados e filtrados de forma adequado, para que danos citados acima sejam evitados, permitindo que coluna e detector permaneçam com boa sensibilidade e especificidade, e assim, resultados confiáveis e reproduzíveis sejam obtidos.
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