Colunas de cromatografia: como escolher a melhor para análises por HPLC e UHPLC

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colunas de cromatografia Modum Tech

A escolha de colunas de cromatografia é algo simples ou mais complexo? Descubra hoje!

O princípio da cromatografia consiste na distribuição dos componentes de uma amostra, decorrente da sua polaridade e interação com uma fase móvel e uma fase estacionária. 

Em metodologias nas quais se aplicam a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC, do inglês: High Performance Liquid Chromatography) ou Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (UHPLC, do inglês: Ultra-high Performance Liquid Chromatography) a fase estacionária consiste em uma coluna. 

Essa coluna é  normalmente de aço inoxidável, empacotada com moléculas que permitem realizar uma interação dos analitos com a coluna. São exemplos: sílica-gel e hidrocarbonetos de 4, 8 ou 18 carbonos.

Mas como escolher a coluna ideal?Continue a leitura e descubra!

Como escolher colunas de cromatografia para HPLC e UHPLC

Escolher a coluna cromatografia para análise não é uma tarefa fácil. Vários fatores influenciam nessa escolha, como a natureza físico-química do analito de interesse, o tipo de fase (normal ou reserva) que vai ser utilizado no método cromatográfico. 

A UHPLC surgiu a partir da necessidade de análises mais rápidas e que apresentassem a mesma, ou superior, eficiência do que as análises realizadas em HPLC. Ambas as técnicas possuem o mesmo fundamento, diferenciando-se, principalmente, no tipo de coluna utilizada. 

As colunas de cromatografia utilizadas em UHPLC possuem recheios que podem variar de tamanho de 1,5 a 2,0 um, e são produzidas a partir de sílica, como as colunas usualmente utilizadas em HPLC, ou então de sílica híbrida, modificadas com os grupamentos de hidrocarbonetos usuais. 

Os parâmetros que devem ser levados em consideração na escolha das colunas de cromatografia são:

  • Natureza química do analito de interesse;
  • Tipo de fase a ser utilizado no método cromatográfico. Em geral, a fase reversa é utilizada nas análises em HPLC, o que não é diferente em UHPLC. Sendo assim, a análise cromatográfica em fase reversa utiliza uma coluna com característica apolar, principalmente coluna C-18, com uma fase móvel composta por um solvente, ou uma mistura de solventes, com característica mais polar, como por exemplo, metanol, acetonitrila e/ou solução tampão;
  • Comprimento da coluna;
  • Tamanho dos poros; entre outros.

Dica: recomenda-se que estudos publicados na literatura sejam revisados, visando a melhor escolha de coluna para utilizar tanto na técnica de HPLC quanto em UHPLC. 

O comprimento da coluna

O comprimento da coluna pode afetar o tempo de retenção de um analito, uma vez que permite que o composto fique interagindo com a fase estacionária por um tempo mais longo. 

Isso, aliás, pode ser útil em análises em que a amostra possua várias substâncias, fornecendo uma melhor resolução entre os picos dos compostos. 

De modo geral, as melhores colunas de se trabalhar consistem naquelas que possuem menor comprimento. No entanto, colunas maiores, como de 250 mm são úteis e importantes em diversas situações. 

As colunas de comprimento maior vão fazer com que a pressão do sistema tenha um aumento significativo, sendo outro ponto a ser avaliado na escolha. 

Com isso, ao escolher uma coluna de 25 cm em vez de uma coluna de 15 cm, devemos analisar se o equipamento cromatográfico sustenta um aumento na pressão sem afetar a eficiência da separação. 

Nesses casos, o uso de UHPLC em comparação com o HPLC é mais vantajoso, já que é um sistema que aguenta maiores pressões.

As colunas preferidas

As colunas C-18, amplamente utilizadas em análises por HPLC e UHPLC, são as preferidas por apresentarem vantagens como uma faixa de resistência de pH (de 2,5 a 8), além de apresentarem picos com melhor resolução e menores fatores de cauda. 

Além do seu diâmetro, normalmente 4 µm, elas fornecem uma análise com um uso menor de solventes, proporcionando economia e menor geração de resíduos. 

A eficiência do processo de separação depende da coluna utilizada. Por exemplo: as colunas de menor tamanho de partícula, vão proporcionar uma resolução mais adequada ao seu método cromatográfico. 

Sendo assim, é preferível que se utilize colunas que possuam partículas de 4,0 µm ou menores. 

Há ainda alguns detectores utilizados na cromatografia que necessitam a utilização de vazão de fase móvel em volumes baixos. 

Exemplo disso são os detectores de massas, que não suportam vazões maiores que, aproximadamente, 0,8 mL/min e consequentemente as colunas devem ser de tamanhos menores, evitando falhas na separação da amostra e danos no detector e equipamento.

Esperamos que tenha gostado deste conteúdo. E caso queira informações sobre colunas HPLC, fale com a Modum Tech!

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