Coluna HPLC: como evitar problemas nas suas análises

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cuidados com a coluna hplc

A coluna HPLC é um dos principais componentes do cromatógrafo líquido de alta eficiência, já que é nele que vai ocorrer todo o processo de separação das substâncias de uma mistura. 

Sendo assim, o cuidado com esse equipamento é um dos pontos que mais devem ser levados em consideração durante uma pesquisa e análise. 

Por isso, vamos explicar neste artigo sobre os cuidados com as colunas, para evitar problemas nas análises. Acompanhe!

Cuidados com a coluna HPLC

É recomendado que todas as amostras sejam filtradas antes de serem injetadas no equipamento, seja por filtros de seringa que possuam 0,45 ou 0,22 µm. 

Além disso, a utilização de pré-colunas, que são equipamentos pequenos que possuem a mesma fase estacionária da coluna principal que tem como finalidade de proteção da coluna cromatográfica, pode ser uma alternativa que auxilia na sua vida útil. 

Os filtros e pré-colunas vão impedir que haja um acúmulo (entupimento da coluna) de substâncias retidas na coluna analítica. 

A fase móvel utilizada durante a corrida cromatográfica também deve ser filtrada, uma vez que sua passagem pela coluna ocorre de forma constante em uma análise. 

Em colunas de alta eficiência é mais possível se ter processos de deterioração causados por entupimento, já que é mais provável que um enchimento de 3 µm que é protegido por frits de 0,5 µm do que um enchimento de 5 µm ou maior, protegido por um frits de 2 µm.

Além da filtração da fase móvel, a sua compatibilidade com a coluna cromatográfica também deve ser avaliada. 

A faixa de pH que as colunas em fase reversa mais utilizada resistem varia entre 1,5 e 9, sendo que em valores de pH altos, a utilização de soluções tampão são necessários para que haja uma estabilidade do sistema. 

A coluna principal é protegida pela pré-coluna já que há uma dissolução das partículas de sílica, o que consequentemente faz com que o enchimento de sílica da coluna principal não seja afetado pelo alto valor de pH da fase móvel. 

Quando é necessária a utilização de fases móveis que possuam pH maiores que 9, a coluna cromatográfica escolhida obrigatoriamente deve possuir estabilidade até pH 12, para que as colunas que não tenham essa capacidade não sejam danificadas. 

As soluções tampões 

As soluções tampões podem ser orgânicos ou inorgânicos (quando utilizados fosfatos ou carbonatos), e quando há a necessidade da utilização de tampões inorgânicos, a limpeza da coluna analítica deve ser realizada de forma correta, uma vez que pode acontecer a precipitação dos sais dentro da coluna cromatográfica e consequentemente deteriorar a fase estacionária, causando grandes prejuízos. 

O entupimento da entrada da coluna é outro desafio comum evidenciado em cromatografia, o qual pode ser evitado limpando a coluna, deixando-a de forma invertida e a conectado à bomba, sem conectar ao detector. 

A quantidade de aproximadamente 100 mL de fase móvel, em vazão de 0,5 mL/min deve ser suficiente para que haja uma limpeza eficiente da entrada da coluna, retirando pequenas partículas que podem estar depositadas. 

Os vazamentos são situações e problemas que podem ocorrer durante sua análise, e para que eles sejam evitados, é aconselhado que não as peças fornecidas pelos fabricantes não sejam substituídas, já que os encaixes podem ser incompatíveis e em primeiro momento um encaixe que aparentemente seja confiável, no entanto, após repetidas conexões podem ficar relaxadas e assim causar vazamentos. 

O correto armazenamento da coluna

O correto armazenamento da coluna analítica é um fator que influencia quando queremos que a vida útil da coluna aumente, para que não tenhamos uma coluna com problemas. 

As colunas em fase normal possuem a recomendação de serem armazenadas em heptano/ 2-propanol ou em outro solvente inerte, que não haja aditivos. 

Já as colunas que possuem fase estacionária reversa, é recomendado que devem ser mantidas em mistura de água/modificador orgânico, por isso é necessário que haja uma lavagem com solventes adequados no final da análise cromatográfica de no mínimo 15 minutos. 

O solvente deve ser aprótico, evitando assim que haja uma acidificação pela liberação de íons H+ que há em solventes próticos. Todos os tipos de colunas devem ser armazenados em temperatura ambiente (18 – 26 ºC), com adequado fechamento das pontas da coluna. 

Isso evita que haja o ressecamento da fase estacionária durante o período em que a coluna permanece armazenada, e também, preferencialmente, devem ser mantidas em suas caixas originais fornecidas pelo fabricante.

Uma coluna está em processo de deterioração quando em um cromatograma são evidenciados picos com formatos ruins, picos indesejados, divididos, com caudas longas, além de diminuição da resolução entre dois picos, diminuição do tempo de retenção dos compostos e pressão do sistema cromatográfico. 

No entanto, se a realização dos cuidados citados durante a sua análise cromatográfica, a coluna pode durar anos com o mesmo grau de eficiência de quando recentemente adquirida.

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