A cromatografia líquida é um processo químico que consiste na separação de mistura de compostos, desempenhando processo fundamental em áreas industriais e de pesquisa. Seus objetivos gerais são separar, identificar, quantificar e até mesmo purificar os analitos e substâncias de interesse.
De forma mais exemplificada, a cromatografia possibilita a separação de cada componente de uma mistura, por mais complexa que seja esta mistura. A separação ocorre pela sua distribuição em duas fases, uma estacionária e uma fase móvel.
A técnica cromatográfica, com o decorrer das décadas, tornou-se uma ferramenta analítica extremamente eficiente e versátil, resultado do grande desenvolvimento de seus acessórios, incluindo, a evolução de um de seus componentes, a coluna cromatográfica.
Isso permitiu a otimização de tempo de análise, da capacidade de seletividade, da eficiência da metodologia, precisão de resultados e baixo consumo de solventes, assim como a identificação e/ou a quantificação dos compostos presentes com confiabilidade e baixo custo operacional.
As colunas de cromatografia e suas utilizações são foco do post de hoje. Continue a leitura e saiba mais sobre esse componente!
Entendendo melhor as fases da cromatografia
As duas fases que fazem parte da cromatografia são: a fase móvel que é composta por um solvente ou uma mistura de dois ou mais solventes, quando aplicado a metodologia de cromatografia líquida, ou ainda pode ser um gás inerte quando aplicado cromatografia gasosa.
Os gases mais utilizados como gás de arraste em cromatografia gasosa são o hélio, hidrogênio ou argônio. Esta fase móvel atua sob alta pressão permitindo que o soluto seja arrastado pelo equipamento cromatógrafo, chegando até a coluna (suporte de aço inoxidável que comumente sustenta a fase estacionária), onde a partir de forças físicas e químicas (como diferenças de polaridade) faz com que este seja retido na coluna.
A fase estacionária (ou fase fixa) é composta por partículas sólidas que estão empacotadas em uma coluna, como citado anteriormente, que podem possuir diferentes polaridades, dependendo da sua composição, o que permite que a partir da sua interação com cada composto da amostra, cada analito presente na mistura apresente um tempo de retenção distinto, possibilitando assim a separação.
O que é uma coluna de cromatografia?
A cromatografia líquida pode ser subdivida em dois tipos: a cromatografia clássica e a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE ou HPLC, do inglês: High Performance Liquid Chromatography).
A diferença destes dois tipos de cromatografia consiste na coluna cromatográfica utilizada.
A cromatografia clássica utiliza colunas de vidro com diâmetros internos de aproximadamente 10 a 50 mm e recheadas com partículas de fase estacionária que possuem diâmetros de 150 a 200 µm.
A a cromatografia líquida de alta eficiência emprega uma fase móvel composta por solventes e uma fase estacionária contida em colunas fechadas de aço inoxidável, que possuem diâmetros de aproximadamente 3 a 5 mm e 1 a 4,6 mm.
Além disso, na cromatografia líquida de alta eficiência, é necessário que a fase móvel esteja pressurizada a altas pressões, possibilitando ter vazões suficientes para que haja a eluição do composto de interesse.
As colunas empregadas na cromatografia líquida de alta eficiência são produzidas de aço inoxidável, assim como as colunas de cromatografia gasosa, mas além disso, existem outros tipos de coluna, como as produzidas com titânio ou ainda polímeros de PEEK.
A fase estacionária é mantida dentro destes suportes entre dois filtros, e o tipo e tamanho do recheio da coluna, assim como o seu tamanho e diâmetro são escolhidos pelo analista, sempre sendo dependente da amostra a ser avaliada, verificando as propriedades físico-químicas do analito para que a coluna ideal para a análise seja escolhida.
Estas colunas variam de 5 a 60 centímetros e são consideravelmente pequenas, quando comparadas com as colunas de cromatografia gasosa, possuindo diâmetros de 2 a 5 mm. Quando as colunas possuem até 30 centímetros são classificadas como colunas preparativas e quando possuem até 60 centímetros são denominadas de semipreparativas, cada uma possuindo uma finalidade apropriada.
O recheio das colunas também possuem características químicas diferentes e quando este recheio possui características polares, o sistema é chamado de cromatografia em fase normal (sendo empregado uma fase móvel com polaridade oposta, neste caso fase móvel deverá ser apolar), já quando o recheio possui características apolares o sistema é denominado de cromatografia em fase reversa (sendo a fase móvel empregada de característica polar), sendo este último sistema o mais comumente empregado nas análises.
Para que são usadas as colunas de cromatografia?
As colunas são as responsáveis por possibilitar a separação dos compostos da mistura. O analito deve ser capaz de interagir tanto com a coluna quanto com a fase móvel, tendo polaridade suficiente para isto.
A coluna, se for apolar por exemplo, vai permitir que a substância fique retido nela por um determinado tempo devido a interação química e para que ele seja eluído e não fique o tempo todo retido na coluna, em algum momento o analito deve interagir com a fase móvel.
Se não ocorre a interação com as duas fases (móvel e estacionária) o analito não seria retido pela coluna, em momento nenhum, ou então a ligação com a fase estacionária seria tão forte que a sua eluição não iria ocorrer ou demoraria tempo demais.
De modo geral, a coluna deve ser escolhida de acordo com a sua aplicação e sendo compatível com as características físico-químicas do analito.
Quais os tipos de colunas cromatográficas e quais suas aplicações?
São disponibilizados diferentes tipos de colunas e com qualidades diferentes. As colunas de sílica ligada em fase reserva são as mais utilizadas e sua faixa de suporte de pH varia entre 2 e 8, no entanto, existem outros tipos de colunas que aguentam faixas maiores de pH, apresentando maior estabilidade.
Os recheios das colunas de fase reserva mais encontradas são as octil, octadecil, fenil e cianopropil. Além disso, devido a seu material, altas temperaturas podem ser empregadas na análise, o que pode favorecer e melhorar a separação cromatográfica.
Apesar disso, são raros os casos que temperaturas maiores que 60 °C são empregados, já que pode haver degradação dos compostos na fase estacionária, por isso, é importante o conhecimento prévio da estabilidade térmica do composto, antes da aplicação de altas temperaturas.
O que são colunas para cromatografia gasosa?
As colunas para cromatografia gasosa são aquelas empregadas em sistemas cromatográficos que utilizam como fase móvel o gás de arraste.
Existem dois tipos de colunas para cromatografia gasosa: as colunas empacotadas (também chamadas de colunas recheadas) e colunas capilares (também chamas de coluna tubular aberta).
As colunas empacotadas não têm sido muito empregada nos últimos anos, já que seu uso é bastante limitado. O tamanho médio destas colunas são de 2 metros e diâmetro externo de cerca de 2 – 4 mm, sendo recheadas com sólido pulverizado na qual a fase estacionária sólida ou líquida é depositada sobre as partículas do recheio.
As colunas capilares são maiores que as citadas anteriormente, possuindo tamanho de 12 a 60 metros e diâmetros externos de 0,1 – 0,53 mm, contendo paredes internas recobertas com um filme fino de fase estacionária, que pode ser sólida ou líquida e são mais utilizadas já que podem fornecer uma melhor resolução de separação.
As colunas capilares podem, ainda, ser de dois tipos: com paredes recobertas (WCOT) onde a fase estacionária esta ligada de forma direta a parede do tipo ou com suporte recoberto (SCOT) na qual existe uma camada de suporte sólido que está depositada a parede interna do tubo e recoberta com a fase estacionária.
Atualmente é possível se obter colunas abertas tubulares com camada porosa (PLOT), onde há uma camada bem fina de adsorvente sólido que é colocada homogeneamente na parte interna da coluna.
No entanto, a estabilidade mecânica deste tipo de coluna não é tão boa quando comparada com as colunas capilares que possuem fases líquidas, sendo necessários cuidados redobrados ao utilizá-las.
Quando se utiliza uma fase estacionária composta por partículas de líquido sobre sólido, o líquido deve ter alto ponto de ebulição e ainda, pode ser polar, quando utilizada polifenóis no seu recheio, apolar quando são compostas de hidrocarbonetos saturados ou intermediária, quando a fase estacionária é composta por cetonas e ácidos carboxílicos.
Os cuidados e como resolver problemas com colunas de cromatografia
A coluna cromatográfica é a peça chave para a separação cromatográfica, que, de acordo com a interação com o analito, permite que eles fiquem retidos e assim a separação ocorra.
Os cuidados com a coluna são essenciais, sendo os principais problemas gerados devido a má instalação e/ou armazenamento, o que pode fazer com haja uma dispersão do pico cromatográfico, formato ruim, perda de resolução, variação dos tempos de retenção, além de aumento da pressão do sistema e ainda pode haver casos que haja danos permanentes na coluna. As colunas devem ser instaladas sempre na direção marcada do fluxo, respeitando os limites operacionais e de aplicação, principalmente relacionados à estabilidade em diferentes pH.
Antes de começar a análise, o equilíbrio da coluna deve ser realizado, com aproximadamente 10 a 20 volumes da coluna e o tempo de estabilização do sistema deve ser respeitado, ajustando o fluxo de trabalho (normalmente 1 mL/min) para que a pressão fique estável e assim não haja variação nas respostas obtidas.
Sempre ao final da análise é necessário e importante que seja realizada a limpeza da coluna, comumente é utilizado um solvente que seja capaz de eluir todos os resquícios que de substâncias que podem ter permanecido na coluna.
As colunas a base de sílica devem ser armazenadas com solvente sem prótons, sendo o melhor solvente a ser empregado é uma mistura de proporção 50:50 de acetonitrila:água, e o volume de água nunca deve ultrapassar 50% quando se trata de uma coluna de fase reversa.
Quando se trata de uma coluna de fase normal, o melhor solvente de armazenamento é uma mistura de 90:10 de hexano:isopropanol, enquanto para colunas HILIC o melhor é uma mistura de 90:10 acetonitrila:água, e o conteúdo de acetonitrila não deve ultrapassar 90%.
A filtragem da amostra e da fase móvel também é essencial para que a vida útil da coluna seja prolongada, permitindo a eliminação de partículas de vários tamanhos. Sem a filtração micropartículas podem entrar na coluna, causando problemas de pressão é possível adsorção de forma irreversível pelo material de enchimento da coluna cromatográfica.
Outra medida que pode ser empregada que possibilita uma duração maior da vida útil da coluna é a utilização de uma pré-coluna, evitando que haja interferências indesejáveis no sistema cromatográfico, ficando as partículas retidas na pré-coluna impedindo a sua chegada na coluna analítica.
Uma pré-coluna é uma coluna pequena ou um cartucho que possui um adsorvente ligado com a mesma fase estacionária da coluna cromatográfica, desempenhando o papel de um filtro química, que não só vai impedir a entrada de partículas na coluna principal como também vai evitar que qualquer outro contaminante com uma afinidade elevada com a fase estacionária chegue na coluna.
De forma geral, as formas de prolongar a vida útil de suas colunas é a partir da preparação adequada das amostras conforme necessário, utilizar pré-colunas e filtrar as amostras e fase móvel com o objetivo de remover partículas que possam estragar a coluna, lavar e armazenar as colunas corretamente após o uso, aguardar a sua estabilização para que as amostras sejam injetadas no sistema cromatográfico, e por fim, todo o processo deve ser monitorado e o plano operacional deve ser ajustado conforme for necessário para que suas respostas analíticas sejam reprodutíveis e possuam resolução adequada.
Coluna HPLC é o mesmo que coluna cromatográfica?
Uma coluna de HPLC entra no conceito de coluna cromatográfica, visto que HPLC é um tipo de cromatografia, então sim…
Existem diversos tipos de colunas cromatográficas, como elucidado neste artigo, as colunas para cromatografia gasosa, as colunas de cromatografia clássica e ainda as colunas de cromatografia líquida, como a cromatografia líquida de alta eficiência.
Então uma coluna HPLC é uma coluna cromatográfica, contudo, nem toda coluna cromatográfica é uma coluna para HPLC, visto que o conceito pode ser amplo.
Esperamos que tenha aproveitado nosso conteúdo sobre colunas de cromatografia. Antes de ir, lembre-se que a Modum Tech é referência em colunas de cromatografia.
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