Como entender a relação entre os grupos funcionais das moléculas e os tipos de colunas cromatográficas? Na verdade, essa relação existe?
Sim, existe! Na verdade, a escolha do tipo de coluna depende de fatores como a característica físico-química dos analitos.
Para aprofundar mais no assunto, reunimos neste artigo os pontos importantes sobre cromatografia, a escolha das colunas cromatográficas, a diferença entre técnicas de cromatografia, como funciona essa relação com os grupos de moléculas e muito mais!
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O que é cromatografia?
A cromatografia é uma técnica analítica utilizada para identificação, separação e isolamento de um ou mais analitos de interesse e/ou estudo que estejam presente em uma amostra complexa.
Existem alguns tipos de cromatografia, no entanto, quando falamos sobre a relação entre grupos funcionais de moléculas e o tipo de coluna a ser empregada na análise quer dizer que há o emprego de um sistema mais complexo do que a cromatografia clássica, como a cromatografia líquida de alta eficiência ou a cromatografia a gás.
Os tipos de cromatografia
A cromatografia líquida de alta eficiência é uma técnica amplamente empregada em diversas áreas industriais e acadêmicas, é composto basicamente por um injetor, um sistema de bombas, uma fase móvel, uma fase estacionária, um forno (onde é armazenamento a fase estacionária durante a análise) e um detector, que pode variar de acordo com a finalidade da análise, diferenciando-se essencialmente em termos de sensibilidade e especificidade.
A cromatografia a gás também é composta por quase as mesmas partes, sendo elas: a fase móvel, um regulador de pressão, o injetor da amostra, a fase estacionária contida em um forno e o detector.
A diferença entre as duas técnicas, como o nome já sugere, é que a fase móvel de uma é composta por um ou uma mistura de solventes (fase móvel líquida), enquanto da outra técnica analítica a fase móvel é um gás inerte, sendo os mais comumente utilizados hélio e nitrogênio.
A fase estacionária é constituída por partículas porosas esféricas e que são capazes de suportar altas pressões. Na cromatografia líquida de alta eficiência, quando temos uma fase estacionária com caráter polar e a fase móvel é composta por solvente(s) apolar(es) é denominada cromatografia de fase normal, ao contrário, quando temos a fase estacionária com característica apolar e fase móvel polar, é chamada de cromatografia de fase reversa.
Tipos de colunas cromatográficas: como escolher de acordo com os grupos funcionais de moléculas
Conforme dissemos no início, a escolha do tipo de coluna a ser empregada no sistema cromatográfico depende de alguns fatores e um deles é a característica físico-química dos analitos.
Quando é usada uma coluna de fase reserva no sistema cromatográfico (fase estacionária apolar) as moléculas que possuem grupos funcionais que dão característica polar para o analito, temos uma baixa retenção dessas moléculas, assim como também pode acontecer a baixa retenção das moléculas iônicas.
Mas por que isso acontece?
Quando a molécula é mais polar, a sua afinidade ocorrerá de forma preferencial aquelas substâncias que possuem polaridade semelhante, e neste caso, será a fase móvel, e assim, o analito fica brevemente retido na coluna, mas logo já interage com a fase móvel e consequentemente seu tempo de retenção será menor.
Essa limitação de baixa retenção das moléculas polares pode ser contornada ao empregar uma fase estacionária com característica apolar (fase normal), apesar disso, a solubilidade das moléculas polares em fase móvel apolar não aquosas, torna limitada a aplicação dessa técnica.
Outro tipo de coluna cromatográfica
Existe ainda a possibilidade de empregar outro tipo de coluna no sistema cromatográfico, a HILIC (do inglês: hydrophilic interaction chromatography) onde as fases estacionárias são tradicionalmente conhecidas como sílica pura, modificada com grupos triazóis, cianos, amidas, entre outros e ainda podem ser a base de ciclodextrinas ou polímeros.
Quando podemos empregar coluna do tipo HILIC? A análise de peptídeos e ácidos nucleicos, que possuem baixa retenção em fase reserva, pode ter uma maior eficiência ao utilizar colunas HILIC.
O que avaliar antes de iniciar uma análise cromatográfica?
Sendo assim, ao iniciar uma análise cromatográfica é necessário que diversos pontos sejam avaliados para que os melhores parâmetros sejam selecionados e assim seus resultados tenham maior confiabilidade, precisão e exatidão.
É importante conhecer a natureza químico-física da molécula de interesse, conhecer sua estrutura e, principalmente, sua polaridade.
A molécula com dois polos que realizam a interação por força de dipolo induzido possui característica polares e assim, é mais interessante cromatografia em fase normal seja empregada, permitindo que haja uma maior retenção na coluna e assim o composto não seja eluído de forma precoce.
No entanto, quando não se tem a possibilidade de utilizar fase normal, outros tipos de coluna podem ser empregados para moléculas mais polares na cromatografia em fase reversa.
Como? Empregando uma coluna C8, por exemplo, que possui uma maior polaridade (em comparação com uma coluna C18), o que consequentemente pode permitir que o composto seja mais retido e assim sua análise seja realizada com sucesso.
