Para que os processos em uma cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) sejam bem sucedidos é preciso que previamente sejam analisadas todas as possibilidades de falha.
Isso significa que com alguns passos é possível prever, evitar e até resolver problemas que possam ocorrer. Sabemos que, por mais que se tenha cuidado, nenhum processo está 100% livre de falhas.
Na CLAE não é diferente. Pode acontecer com o cromatógrafo, com as colunas ou com os solventes, por exemplo. Por isso, vamos mostrar aqui os cuidados que devem ser tomados para que os processos de cromatografia aconteçam sem problemas.
Continue a leitura e saiba mais!
O cromatógrafo de alta eficiência
O cromatógrafo líquido de alta eficiência é um equipamento muito empregado em diversas áreas industriais.
Ele tem como finalidade a identificação, isolamento e purificação de uma determinada substância que esteja presente em uma mistura complexa, trabalhando de forma controlada e reprodutiva. Ou seja, os métodos analíticos desenvolvidos e validados para a cromatografia líquida de alta eficiência devem possuir a capacidade de serem reproduzidos em qualquer parte do mundo.
De forma básica, este equipamento é composto pelas seguintes partes:
- um sistema de fase móvel, composta por um ou mais solventes;
- o injetor das amostras;
- as bombas cromatográficas, que vão fornecer a pressão suficiente para a fase móvel percorrer todo o sistema cromatográfico e assim as amostras sejam carregadas desde o vial até o coletor de resíduo, passando por todos as partes do equipamento;
- um forno onde fica armazenada a coluna cromatográfica, que é é um componente normalmente feito de aço inoxidável, que contém a fase estacionária;
- o detector, que pode variar dependendo do objetivo da análise e ainda do quão sensível é necessário que seja para que seus resultados obtidos tenham confiabilidade suficiente e um software de operação.
Antes de iniciar uma análise no cromatógrafo líquido de alta eficiência, algumas etapas prévias devem ser realizadas, como:
- o preparo da fase móvel;
- a instalação da coluna no forno;
- purga e limpeza do injetor automático;
- aguardar a estabilização do sistema.
Todos esses procedimentos, se não realizados de forma suficiente, podem desencadear problemas futuros no equipamento.
Por isso, antes de saber os passos de como resolver um problema em determinado equipamento, é necessário conhecer o seu funcionamento normal e assim, quando ocorrer alguma situação anormal, você será capaz de identificar e assim providenciar a solução deste problema.
Quais são os primeiros cuidados para que sejam evitados problemas no equipamento?
O cuidado com a fase móvel é um dos principais itens que devem ser bem preparados.
A fase móvel é o que permite que a amostra seja transportada por todo o sistema cromatográfico, chegando na fase estacionária para realizar a interação com as partículas da fase estacionária e depois seja eluida até o detector.
Todos os solventes utilizados na fase móvel de um sistema cromatográfico devem possuir alto grau de pureza, normalmente classificados como “pureza HPLC”, evitando que eventualmente possa haver partículas em suspensão nesses solventes.
Quando há alguma partícula em suspensão, o entupimento da bomba pode acontecer, fazendo com que a pressão do cromatógrafo fique alta demais. Além disso, problemas na coluna e no detector podem ser gerados a partir da utilização de solventes não apropriados.
Quando se utiliza água como fase móvel, esta deve ser ultrapura e todos os solventes e amostras devem ser filtrados.
Com soluções tampões os cuidados devem ser redobrados, uma vez que são sais dissolvidos e estes se ficarem parados no sistema podem precipitar e consequentemente entupir o sistema e/ou danificar o pistão da bomba cromatográfica.
Como filtrar as soluções que são utilizadas no sistema cromatográfico?
Podem ser utilizadas três formas:
- filtração a vácuo;
- filtros de linha no sistema CLAE;
- filtração por filtros de membrana.
Além disso, é necessário realizar a degaseificação dos solventes da fase móvel, removendo bolhas de ar que possam estar presente no frasco de armazenamento que podem atrapalhar na obtenção dos resultados, alterando o tempo de retenção de certos compostos e ainda pode dificultar a estabilização do sistema.
A degaseificação pode ser realizada a partir do banho ultrassônico e a partir do degasser que o sistema já possui.
Cuidados com a coluna cromatográfica
A coluna cromatográfica possui a fase estacionária que retém os analitos de interesse de acordo com a interação e assim os compostos são separados.
Os cuidados com a coluna de cromatografia são essenciais, já que os problemas gerados por uma instalação e/ou armazenamento inadequados podem levar à dispersão do pico, formato ruim, perda de resolução, variação dos tempos de retenção, aumento da pressão e até danos que podem permanentes na coluna.
As colunas cromatográficas devem ser utilizadas sempre na direção marcada do fluxo, respeitando os limites operacionais e de aplicação.
Antes do início da análise, deve ser realizado o equilíbrio da coluna, com aproximadamente 10 – 20 volumes da coluna. As especificações de cada coluna cromatográfica devem ser lidas com atenção, para que ela seja armazenada com solvente adequado.
O tempo de estabilização do sistema deve ser respeitado. É necessário ajustar o fluxo de trabalho da fase móvel (por exemplo: 1 mL/min), aumentar o fluxo de forma gradual até que chegue no fluxo desejado. O tempo de estabilização é quando a base e a pressão do sistema ficam estáveis.
Aqui os principais pontos que devem ser cuidados em um sistema cromatográfico foram elucidados, no entanto, todo o processo de análise deve ser cuidadosamente realizado para que tanto o equipamento quanto a coluna possuam uma vida útil maior e ainda, para que seus resultados passem confiabilidade, reprodutibilidade e sensibilidade.
E então, nosso conteúdo foi útil? Você tem algo a compartilhar conosco sobre suas experiências com cromatografia líquida de alta eficiência? Conte nos comentários.
