Quais cuidados devem ser observados nos processos de desenvolvimento cromatográfico? É o que vamos a partir de agora!
A cromatografia é um processo de separação mais utilizado como forma de identificação e quantificação de amostras.
A cromatografia líquida de alta eficiência e a cromatografia gasosa são os dois tipos de cromatografia que possuem alta sensibilidade e precisão mais comuns, sendo escolhido principalmente pelo tipo de amostra a ser analisada.
Ao desenvolver um novo método cromatográfico, o objetivo do analista é fornecer uma metodologia que entregue resultados satisfatórios principalmente na questão de reprodutibilidade e especificidade.
Além de todos os cuidados que se devem ter com a escolha dos solventes, o tipo de coluna que vai ser empregado em ambos os tipos de cromatografia, também devemos dedicar uma devida atenção no que se refere ao preparado da amostra que será injetado no sistema cromatográfico.
Por isso, elaboramos este artigo no qual apontamos alguns aspectos importantes sobre os cuidados com o preparo da amostra no desenvolvimento cromatográfico. Saiba mais!
Desenvolvimento cromatográfico e os cuidados com os processos de preparação de amostras
Como sabemos, vários fatores influenciam na qualidade e confiabilidade dos resultados obtidos nos cromatogramas, como pureza de solventes (tanto aqueles utilizados no preparo de fases móveis quanto os empregados em processo de solubilização e/ou diluição de amostras), tipo de fase estacionária a ser utilizada (com característica polar ou apolar) e ainda, o modo de preparo da amostra.
Desse modo, não basta apenas dissolvermos e solubilizarmos os analitos em solventes adequados, mas também a amostra deve estar livre de partículas em suspensão, e ter o analito de interesse a ser quantificado.
O solvente utilizado na solubilização e/ou diluição das amostras, devem ter o grau de pureza adequado (grau HPLC), assim reduz as chances de contaminação das amostras a serem analisadas e os riscos de interpretação inequívoca de dados são menores.
Ainda, a utilização desses solventes grau HPLC na preparação de amostras nos garante que não eles não possuem partículas em suspensão que possam causar um entupimento nos canais do equipamento cromatográfico ou uma deterioração da coluna cromatográfica, decorrente a deposição dessas partículas.
A solubilidade do analito no solvente a ser empregado deve ser devidamente investigada, assim como nos solventes utilizados na fase móvel, evitando que quando ocorra a interação entre o analito e a fase móvel, não ocorra sua precipitação e assim não haja deposição do analito no sistema e impeça ele de ser quantificado ou até danifique o equipamento.
A filtração da fase móvel e da amostra é uma etapa que deve sempre estar na rotina de uma análise cromatográfica. Além da preparação das amostras com solvente com alto grau de pureza, antes de injetar no sistema cromatográfico, durante o preparo de amostra, elas devem ser filtradas.
Como fazer isso?
Comumente são empregados filtros de seringa nessa etapa, que podem ser escolhidos levando em consideração o diâmetro do filtro, o tamanho do poro e compatibilidade química com a amostra.
Diâmetro do filtro
A escolha baseada no diâmetro é decorrente do volume total de amostra a ser filtrado, de forma básica, volumes menores são compatíveis com diâmetros menores de filtros de seringa quando comparado com diâmetros maiores, sendo assim temos:
Volumes entre 1 e 10 mL o filtro ideal é de 13 mm de diâmetro;
Volumes entre 10 e 100 mL o filtro ideal é de 25 mm de diâmetro;
Volumes maiores é adequado empregar outros métodos de filtração.
Tamanho do poro
O segundo ponto que pode ser levado em consideração é a porosidade do filtro. Os filtros de seringa possuem poros de 0,45 e 0,22 µm e suas indicações são as seguintes:
Filtros com poro de 0,45 µm são indicados para filtração de amostras que serão injetadas e analisadas por cromatografia líquida de alta eficiência, clarificação de amostras, filtração de amostras biológicas, ambientais e/ou alimentares;
Os filtros de 0,22 µm além de serem filtros esterilizantes (ou seja, as amostras podem passar por filtros desse poro para que sejam esterilizadas), são indicados para:
- filtração de amostras que serão analisadas por cromatografia líquida de ultra eficiência (UHPLC);
- espectrômetro de massas (MS);
- cromatografia a gás (CG);
- cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS);
- cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas (CG-MS).
Compatibilidade química
Por fim, os filtros podem ser de fabricados de diversos materiais, sendo a sua compatibilidade química avaliada no momento de compra e aplicação na filtração das amostras.
Por exemplo: há filtros de nylon que possuem uma estabilidade e flexibilidade química excelente, boa durabilidade e resistência; os filtros de acetato de celulose, que possuem uma membrana hidrofílica e possibilita uma baixa retenção de proteínas, sendo ideal para aplicação da filtração de amostras de soluções proteicas e enzimáticas.
Como exemplo de filtros com membrana hidrofóbica, há os filtros de politetrafluoretileno (PPTFE) que possuem grande compatibilidade com solventes químicos.
Sendo assim, avaliando e aplicando todos os cuidados necessário no preparo de amostras para análises cromatográficas, saberemos que os resultados obtidos como resposta sempre serão fidedignos, tanto em termos qualitativos quanto quantitativos.
Para finalizar…
Esperamos que tenha gostado do conteúdo sobre desenvolvimento cromatográfico. Qualquer dúvida ou sugestão, deixe nos comentários ou fale conosco!
