Para entender os efeitos de temperatura em cromatografia líquida de alta eficiência, vamos começar pelos conceitos básicos.
A temperatura como uma variável em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) pode ser considerada recente, uma vez que essa era a principal característica que diferenciava cromatografia gasosa de cromatografia líquida, apesar de seu uso e influência já terem sido descritos há alguns anos.
A temperatura tem efeito em diversos fatores nas análises cromatográficas, mas principalmente no tempo de retenção do analito de interesse. Isso porque altera parâmetros como solubilidade, difusividade, polaridade e viscosidade da fase móvel.
Esse é o tema de nosso artigo. Acompanhe!
Quais os efeitos de temperatura em CLAE?
Apesar de estudos utilizando fase reversa como sendo a principal para avaliar o efeito da temperatura em CLAE, outras publicações já são notadas, utilizando outros sistemas de separação como troca-iônica, interação hidrofílica e fase normal.
A temperatura escolhida associada ao tamanho da coluna cromatográfica pode reduzir o tempo de retenção de um analito, ou ainda aumentar esse tempo, se assim for desejável (como por exemplo, em casos que há dois ou mais analitos os quais não possuam uma resolução adequada entre os picos cromatográfico).
Como mencionado, a temperatura pode alterar algumas características físico-químicas da fase móvel, como a sua viscosidade. A elevação da temperatura proporciona uma diminuição no tempo de retenção, decorrente de ocasionar uma diminuição na viscosidade da fase móvel.
Ainda, como resultado de todas as alterações, há uma redução da pressão do sistema cromatográfico, permitindo que colunas que possuam partículas de diâmetro pequenos (menores que 3 µm) possam ser utilizadas em equipamentos clássicos de CLAE.
A variação de temperatura pode ainda oferecer uma seletividade melhor às colunas cromatográficas. Mesmo que outros fatores também possam oferecer os mesmos resultados, a modificação nos parâmetros de pH, fase móvel e fase estacionária em conjunto com alteração na temperatura a ser estabelecida no método podem proporcionar uma seletividade melhor, quando comparado com a alteração em apenas um parâmetro.
No entanto, deve ser levado em consideração que, em uma primeira análise quando observado uma baixa resolução entre dois picos, apenas a alteração de temperatura não deve ser o suficiente para a obter a resolução desejada (R > 2). Um estudo demonstra que o aumento em 5 ºC na temperatura do forno pode corresponder a aproximadamente um aumento de 1% de acetonitrila em fase reversa.
Como citado anteriormente, se um aumento de 5 ºC na temperatura é o equivalente a aumentar 1% de proporção de acetonitrila. Podemos sugerir que as alterações na temperatura (principalmente no aumento dela) fazem com que uma menor quantidade de solvente de fase móvel seja utilizada e ainda uma diminuição no tempo de interação do analito com a fase estacionária, dessa forma, diminuindo o tempo de retenção dele.
Essa situação é obtida especialmente em fase reversa, já que é comumente a utilização de acetonitrila como fase móvel.
Temperaturas elevadas e as colunas cromatográficas
Dependendo da estabilidade térmica do analito e da coluna, a utilização de temperaturas elevadas (somente em casos especiais) suportadas, principalmente pela coluna cromatográfica para que não haja sua deterioração, pode causar uma eliminação completa da utilização de um solvente orgânica em cromatografia líquida em fase reversa, sendo a fase móvel composta apenas por água ultrapura.
Ou ainda, quando não há a possibilidade de eliminação completa de um solvente orgânico, a variação de temperatura pode oferecer a utilização de etanol, ao invés de metanol ou acetonitrila (solventes comumente utilizados), melhorando o perfil toxicológico do resíduo do CLAE, uma vez que etanol é um solvente menos agressivo do que os outros dois citados.
Além disso, a utilização de etanol em cromatografia líquida de alta eficiência possibilita reduzir a problemática da falta de acetonitrila no mercado nacional, uma vez que o país é um grande produtor de etanol, favorecendo o emprego da química verde em técnicas analíticas.
Quando a proporção de solvente orgânica da fase móvel é baixa e tendo-se a maior parte da proporção voltada a água ultrapura, podemos obter uma detectabilidade melhor do analito pelo detector na região do ultravioleta, já que a água apresenta uma maior transparência nesse espectro, especialmente por volta de 190 nm.
Embora especialmente o aumento da temperatura proporcione algumas vantagens, isso deve ser cuidadosamente avaliado, uma vez que não há dados suficientes descritos que explicam seu efeito sob a vida útil da coluna cromatográfica.
Por exemplo, colunas normalmente empregadas em cromatografia em fase reversa, C18, possuem o uso recomendado de até 60 ºC, apesar de alguns fabricantes fornecerem colunas mais resistentes, as quais suportam mais de 150 ºC.
Estudos breves demonstraram que um aumento excessivo da temperatura reduz a sua vida útil, decorrente da perda do desempenho da coluna, já que há um aumento na hidrólise da ligação entre os C18 e a sílica, materiais que formam a fase estacionária.
O analista deve realizar uma rígida avaliação quando necessitar elevar a temperatura em níveis mais altos, sempre considerando aspectos de prós e contras, principalmente em relação a vida útil da coluna cromatográfica.
Esperamos que nosso conteúdo tenha sido útil e que você tenha gostado.
Antes de ir, lembre-se: se precisar de colunas cromatográficas, fale com a Modum Tech!
