A cromatografia é uma técnica de separação que tem como fundamento a interação dos componentes de uma amostra, com duas fases, fase móvel (FM) e fase estacionária (FE), que são imiscíveis entre elas.
A cromatografia é dividida em duas técnicas: a planar e cromatografia em coluna. Dentre vários tipos de cromatografia, podemos citar a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), que é o tema deste post.
Acompanhe a leitura!
CLAE: como funciona e tipos de colunas utilizados
A CLAE tem como princípio a técnica por coluna, ou seja, a FE é uma coluna, que permanece imóvel no cromatógrafo líquido de alta eficiência. A FM, por sua vez, é uma solução, composta por solventes adequados, que vão permitir com que a amostra seja carreada até a FE.
O analito da amostra deve apresentar interação com os dois tipos de fase. Ou seja, ela deve ter, tanto a capacidade de interagir com a FM, permitindo que ela seja transportada até a FE, quanto com a FE, possibilitando a sua interação com seus componentes. Dessa forma, o analito da amostra fica retido por um período adequado, realizando a sua separação da mistura.
Quanto maior for a interação do analito com a FE, maior será o tempo de retenção.
Partes do cromatógrafo líquido de alta eficiência
Além da FM e FE, o cromatógrafo líquido de alta eficiência é composto por diversas partes:
- uma bomba, que tem como função impulsionar a FM para o sistema do instrumento;
- um injetor, que pode ser manual ou automático, com o objetivo de introduzir a amostra de maneira mais eficiente possível para o sistema cromatográfico;
- o forno, no qual é o local em que fica armazenado a coluna (FE) permitindo que a coluna fique a uma temperatura estável, sendo esse controle de temperatura um fator importante para controlar a precisão do tempo de retenção dos picos;
- os detectores são os responsáveis identificar e quantificar os analitos de interesse, sendo necessário à sua compatibilidade físico-química com os componentes da amostra.
A FE deve ser selecionada cuidadosamente para que haja uma sensibilidade e eficiência adequada no processo de separação e resolução dos picos cromatográficos, quando se trata de uma amostra com mais de dois analitos de interesse.
O material mais associado às fases estacionárias é a sílica, devido a suas características como alta estabilidade química, alta estabilidade térmica, pureza e porosidade.
A coluna pode ser considerada o ponto principal dos sistemas cromatográficos. Ela é formada por um tubo externo, normalmente de aço inoxidável, mas também há colunas produzidas com tubos poliméricos ou de titânio.
A FE fica dentro desse tubo, entre dois filtros que estão um em cada extremidade da coluna.
Tipos de colunas usados para a CLAE
As colunas de cromatografia são classificadas em semipreparativas ou preparativas e as diferenças são:
- Colunas semipreparativas: que possuem até 60 cm e diâmetro interno de 4,6 a 10 mm, com partículas de diâmetro de 10 µm e são usualmente utilizadas para realizar a purificação do material eluido e são utilizados em cromatógrafos que permita fluxos de FM superior a 1 mL/min;
- Colunas preparativas: possuem tamanho de até 30 cm e diâmetro interno de 50 mm e são utilizadas para isolar e identificar um analito de interesse em escala maior do que os obtidos nas colunas semipreparativas.
Em CLAE, o tipo mais comum de mecanismo de separação é a partição. Nesse tipo, a FE é um líquido imiscível com a FM e, normalmente realizada com fase ligada, ou seja, onde a FE é um composto orgânico ligado por ligações químicas.
Nesse tipo de mecanismo, e levando em consideração a natureza química do composto orgânico, a FE pode ser classificada em: Fase Normal e Fase Reversa.
Na Fase Normal, o recheio da FE é polar e consequentemente a FM deve ser constituída por um (ou mais) solvente apolar. Na Fase Reversa, o recheio da FE é apolar e, assim, deve ser utilizada uma FM com constituintes polares, sendo esse tipo de fase o mais utilizado nas análises.
Entre as fases reversas mais utilizadas, se destacam a C2 (etilsilano), C4 (butilsilano), C8 (octasilano) e C18 (octadecilsilano), sendo que a mais conhecida e utilizada é a C18.
Os outros mecanismos de separação
Conheça um pouco sobre os outros mecanismos de separação:
- Adsorção: onde a coluna contém um sólido polar finamente dividido que permite que os analitos sejam adsorvidos por esse sólido;
- Troca iônica: o recheio da coluna é composto por uma resina, que permite que haja uma troca entre os íons. As colunas podem ser trocadoras de ânion, quando apresentam grupos iônicos positivos, ou trocadores de cátions, quando apresentam grupos iônicos negativos e a FM pode ser composta por soluções ácidas, básicas ou tampões;
- Exclusão: O recheio da coluna possui partículas porosas de diversos tamanhos, e a sua separação se dá pelo tamanho molecular dos compostos. Ou seja, as moléculas de maior tamanho como são excluídas dos poros da FE. Assim, não conseguem entrar nesses poros. Por isso, são eluídas mais rapidamente do que as moléculas de tamanho menor, as quais entram nesses poros e ficam interagindo com a FE. Consequentemente, moléculas maiores possuem um menor tempo de retenção do que moléculas pequenas.
Esperamos que tenha gostado deste conteúdo. E caso queira informações sobre colunas HPLC, fale com a Modum Tech!
