Precisamos falar sobre as boas práticas no uso de HPLC.
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC, do inglês High Performance Liquid Chromatography) é uma técnica analítica essencial em diversos segmentos, especialmente na indústria farmacêutica, cosmética, alimentícia e ambiental.
Sua capacidade de separar, identificar e quantificar componentes em uma mistura complexa com alta sensibilidade e precisão depende diretamente de uma série de fatores operacionais e do cuidado rigoroso com os insumos e equipamentos utilizados.
Entre os elementos mais críticos para o desempenho e a robustez das análises estão as colunas cromatográficas, os solventes e os padrões analíticos. A adoção de boas práticas no uso desses componentes é fundamental para garantir a reprodutibilidade dos resultados, a longevidade dos equipamentos e a integridade dos dados gerados.
Entenda as boas práticas no uso de HPLC
Em relação às colunas cromatográficas
As colunas cromatográficas são o coração do sistema de HPLC. Elas contêm a fase estacionária responsável pela separação dos analitos e, portanto, merecem atenção especial.
O primeiro cuidado fundamental é evitar choques mecânicos e variações bruscas de pressão, pois a embalagem da coluna pode se comprometer, resultando em perda de eficiência e alargamento dos picos cromatográficos. A instalação da coluna deve ser feita com cuidado, utilizando conexões adequadas e assegurando-se de que não haja bolhas de ar no sistema, que podem prejudicar significativamente a separação.
Além disso, a coluna deve ser compatível com a natureza da amostra e das fases móveis utilizadas. Por exemplo, colunas de fase reversa (como C18) são ideais para compostos moderadamente polares, enquanto colunas de fase normal são preferidas para analitos muito polares ou lipofílicos.
Outro ponto essencial é a manutenção da coluna durante os períodos de uso e armazenamento. Sempre que possível, deve-se evitar a injeção de amostras com partículas em suspensão, utilizando filtros de seringa ou pré-colunas (guard columns) para proteção.
A limpeza periódica da coluna é recomendada, utilizando gradientes de solventes fortes compatíveis com a fase estacionária. Durante longos períodos de inatividade, a coluna deve ser armazenada em solvente adequado (frequentemente uma mistura de acetonitrila e água ou metanol), evitando o ressecamento da fase estacionária. O pH da fase móvel também deve ser rigorosamente controlado, uma vez que valores extremos podem degradar a fase estacionária, especialmente em colunas de sílica modificada.
Em relação aos solventes
Os solventes utilizados na HPLC devem ser de grau cromatográfico, isto é, altamente purificados e livres de contaminantes que possam interferir na detecção ou danificar o sistema. Solventes de baixa pureza podem introduzir ruídos de fundo elevados, contribuir para a formação de resíduos em bombas e válvulas, além de acelerar o desgaste da coluna.
Portanto, devem-se utilizar solventes de qualidade HPLC, preferencialmente adquiridos de fornecedores confiáveis e armazenados em frascos de vidro âmbar, bem vedados e em locais protegidos da luz e da umidade. É importante também realizar a filtração e desgaseificação da fase móvel antes do uso.
A desgaseificação pode ser feita por ultrassom, purga com gás hélio ou sistemas de vácuo. A presença de bolhas de gás pode afetar a precisão do sistema de bombeamento, introduzindo variações de fluxo que comprometem a repetibilidade das análises.
Além disso, deve-se atentar para a preparação correta das misturas de solventes. É comum o uso de sistemas binários ou ternários de fase móvel (como água e acetonitrila ou metanol), e a ordem de mistura pode influenciar a formação de microbolhas ou precipitados.
Por exemplo, ao preparar uma mistura aquosa com ácido fosfórico em acetonitrila, é recomendável adicionar o ácido à água primeiro, e depois misturar com o solvente orgânico. A correta rotulagem, anotação da data de preparo e prazo de validade das soluções também são medidas importantes para evitar erros analíticos e garantir a rastreabilidade dos dados.
Em relação aos padrões analíticos
Os padrões analíticos são outro componente fundamental na HPLC, pois são utilizados para a calibração do sistema, identificação de picos e quantificação dos analitos. A qualidade do padrão utilizado determina diretamente a confiabilidade dos resultados. Deve-se utilizar padrões de pureza conhecida e certificada, preferencialmente acompanhados de certificados de análise (CoA).
Os padrões devem ser pesados com precisão em balança analítica calibrada e dissolvidos em solventes compatíveis com a fase móvel e com a estabilidade da substância. A concentração do padrão deve ser adequada à faixa de detecção do equipamento e à linearidade do método analítico.
Armazenar os padrões de forma correta também é essencial. Muitos compostos são sensíveis à luz, temperatura e umidade, exigindo armazenamento em condições refrigeradas, em frascos âmbar, e com vedação hermética. Soluções padrão devem ser preparadas com frequência adequada, de acordo com sua estabilidade química, e descartadas após o vencimento.
É recomendável registrar todas as etapas do preparo, incluindo lote do padrão, pesagem, volume de diluição, solvente utilizado e data de validade. O uso de soluções padrão internas pode ser uma estratégia eficaz para compensar variações instrumentais e de preparo da amostra, contribuindo para maior exatidão nas análises quantitativas.
As boas práticas em HPLC garantem a eficiência da separação, a estabilidade do sistema e a validade dos resultados
O uso adequado da HPLC requer um conjunto de boas práticas que envolvem o cuidado criterioso com as colunas cromatográficas, a escolha e o manuseio correto dos solventes, e a preparação e armazenamento apropriados dos padrões analíticos.
Negligenciar qualquer um desses aspectos pode comprometer a eficiência da separação, a estabilidade do sistema e a validade dos resultados. Por isso, a capacitação contínua dos analistas, a padronização de procedimentos e a manutenção preventiva dos equipamentos são medidas indispensáveis para garantir a excelência nas análises por HPLC.
A atenção aos detalhes, aliada ao rigor técnico, é o que assegura não apenas resultados confiáveis, mas também a conformidade com as exigências regulatórias e de qualidade cada vez mais presentes nos ambientes laboratoriais modernos.
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