A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), também conhecida como HPLC (High Performance Liquid Chromatography), é uma técnica analítica amplamente utilizada em laboratórios de química e bioquímica.
A CLAE/HPLC é empregada para separar e identificar os componentes de uma amostra com alta precisão e sensibilidade. No entanto, durante o processo de análise, podem surgir problemas que afetam a qualidade dos resultados obtidos.
Nesse sentido, a aplicação de metodologias de análise qualitativa e quantitativa, bem como a resolução de problemas e diagnóstico, são fundamentais para garantir a confiabilidade dos dados gerados pela técnica.
Neste artigo, serão abordados os principais aspectos relacionados à análise qualitativa e quantitativa em CLAE/HPLC, bem como a resolução de problemas e diagnóstico, com o intuito de mostrar como obter resultados mais precisos e confiáveis em suas análises.
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A análise qualitativa em CLAE
A técnica padrão ouro de quantificação de determinados analitos em amostras é a cromatografia líquida de alta eficiência, podendo ser aplicada em diversas áreas industriais, como farmacêutica, química e ambiental.
A CLAE/HPLC é um método físico-químico que é empregado na separação de substâncias de uma mistura complexa, mais especificamente os analitos investigados por esta técnica podem ser fármacos, proteínas, aminoácidos, polímeros, contaminantes (como agrotóxicos), componente de plantas e até mesmo polímeros sintéticos e naturais.
Como início de uma análise cromatográfica é realizada uma investigação qualitativa (também chamada de análise qualitativa) que serve como forma de entender a complexidade de um fenômeno, ou seja, os dados tratam-se da qualidade de uma questão e não sobre quantidade.
Primeiramente realiza-se a injeção da amostra com base em descobrir, em situações que não se conhece a composição da amostra, quais são os componentes presentes nesta amostra, ou seja, você vai descobrir de forma qualitativa (ou observacional) quais são as substâncias que estão ali presentes.
A análise qualitativa
A partir desta análise qualitativa, você dá início a análise quantitativa. A análise quantitativa, como o nome sugere, você vai realizar a quantificação daquele analito identificado, de forma qualitativa, na amostra.
De maneira mais simples, a quantificação permite a descoberta da concentração da substância de análise. Em cromatografia líquida de alta eficiência, a análise quantitativa é realizada com base no valor da área do pico cromatográfico obtido.
O pico cromatográfico
A área do pico cromatográfico, comumente, é integrada de forma automática, ou seja, você terá o valor de área do pico assim que a análise estará finalizada, a partir disso você pode aplicar em uma curva de calibração, realizada a partir da substância química de referência do composto estudado e descobrir a real concentração dele na amostra. Esta curva é a relação entre sinal (no caso a área do pico) e a concentração do analito. Esta amostra pode ser uma forma farmacêutica, pode ser o solo, água e outras amostras.
Apesar de parecer fácil, uma análise cromatográfica, seja de forma qualitativa ou quantitativa, exige conhecimento prévio do equipamento cromatográfico, para que em casos de problemas, a resolução deste seja realizada de forma correta.
Possíveis problemas em CLAE/HPLC
Para isso, um dos problemas que pode acontecer é decorrente da má utilização da fase móvel. Todos os solventes devem ser devidamente utilizados no grau de pureza HPLC e antes da sua utilização devem ser filtrados e sonicados.
Quando partículas podem estar suspensas na fase móvel, pode acontecer o entupimento da bomba e assim atrapalhar toda a análise, gerando resultados errôneos, além de fazer com que o equipamento seja prejudicado.
A degaseificação da fase móvel é essencial para a remoção de bolhas que podem permanecer nos frascos de armazenamento, sendo realizada pelo banho ultrassônico, como mencionado anteriormente, ou então pelo degasser do próprio sistema cromatográfico.
Problemas na coluna cromatográfica também podem gerar sérios problemas na resposta analítica. Cuidados na instalação e armazenamento são essenciais para que a vida útil da coluna seja prolongada por maior tempo possível, evitando que problemas de má resolução de pico sejam formados.
Além destes problemas de resolução, alteração no tempo de retenção de determinados analitos podem ser alterados quando há problemas de coluna. As colunas devem ser utilizadas na direção correta do fluxo, sendo este direcionado para o detector do cromatógrafo.
O equilíbrio da coluna também deve ser realizado, antes de cada análise no cromatógrafo líquido de alta eficiência, passando cerca de 10 a 20 volumes total da coluna. De forma geral, as especificações das colunas devem ser lidas atentamente e seguidas de forma rigorosa.
Dicas para resultados positivos nas análises qualitativas e quantitativas em CLAE/HPLC
Outras dicas que podem ser seguidas para que sua análise tanto qualitativa como quantitativa demonstre resultados positivos e confiáveis são:
- Utilizar amostras devidamente filtradas, com filtros de seringa, evitando problemas na coluna, bomba e detector. Caso não seja corretamente filtrada, alguns analitos podem precipitar dentro do equipamento e assim causar o entupimento do sistema.
- Utilizar metodologias que sejam compatíveis com a análise desejada, ou seja, utilizar pH da fase móvel na faixa em que a coluna suporte, além de utilizar a temperatura do forno em faixa que também seja suportada pela coluna, normalmente esta faixa fica entre 4 – 40 °C, no entanto pode haver exceções.
- Verificar a pressão do sistema cromatográfico, evitando que choques de pressão ocorra de forma recorrente, pois pode ocasionar na formação de canais no empacotamento da coluna e assim prejudicá-las.
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